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miRNA荧光定量 PCR(qPCR)检测服务

血清/石蜡包埋样本miRNA荧光定量PCR(qPCR)检测服务

  miRNA 是一类内源性非编码小RNA分子,长约20-23nt。研究表明,miRNA在细胞增殖和凋亡、器官生成、个体发育、造血、脂肪代谢等多种调控中发挥着重要的作用。miRNA表达定量分析是研究其功能的基础, 细胞、临床组织(包括石蜡包埋样本)或血液/清中的miRNA表达水平检测有助于发现新的早期诊断和预测疗效及患者预后的生物标志物。qPCR 技术以其灵敏、准确、易操作等优点,为miRNA表达定量分析提供了良好的技术手段,可更好地对芯片及测序结果进行验证。
  miRNA表达的定量分析是生物功能研究的基础,是当今世界生物学研究的热点领域。细胞、组织或血液中的miRNA表达谱的检测有助于发现新的早期诊断和预测疗效及患者预后的生物标志物。我们为您提供优质的miRNA实时荧光定量PCR整套技术服务。
一、 miRNA qPCR技术服务项目
  1. 根据基因序列设计特异性的引物和荧光探针
  2. 抽提DNA/RNA,逆转录RT-PCR及cDNA扩增
  3. eal-TimePCR(荧光定量PCR),进行实验结果分析  
  4. 特色项目
    a、特殊物种(除人、大鼠及小鼠外)miRNA特异性引物设计(SYBR Green染料法)。本公司设计提供特异性的茎环引物,相较于传统的Olig-dT引物,结果准确率更高。
    b、miRNA 差异性表达数据分析(包括提供t-test结果、实验步骤、扩增曲线图、溶解曲线图、差异表达分析图及原始数据)。
二、 miRNA qPCR技术服务流程
  1. 样品RNA准备
  提供样品总RNA,也可提供组织、血液、细胞类样品,需支付样品的前期处理费用。
  2. RNA质量检测
  紫外吸收测定法测定波长260nm和280nm的吸收值,判断RNA样品的浓度。
  3. 逆转录合成cDNA
  利用茎凸环引物逆转录合成cDNA链。
  4. 实时荧光定量PCR
  以合成的cDNA作为模板进行实时定量PCR扩增(每个样品检测三次,同时检测每个样品中U6 snRNA或5S rRNA含量作为内参,以校正上样误差)。
  5. 分析结果、提供实验报告
  相对定量—分析相对表达参数,提供统计学分析,获得相对表达差异;
绝对定量—依据miRNA标准品制作标准曲线(每条曲线上至少设置5个数据点),以定量样品中的待检测miRNA;
分析实时定量PCR结果,提供实时定量PCR实验数据和扩增曲线,融解曲线,柱状图。
三、miRNA qPCR技术服务样品提供
  a. RNA样品:取10µg总RNA,并提供RNA质量检测图。要求浓度在500ng/µl以上,体积在20µl以上,OD260/OD280的比值在1.8至2.0之间,电泳检测28s的亮度约为18s的两倍。-80℃贮存,干冰运输。
  b. 组织样品:请将200mg以上的组织样本,并分装为两管。-80℃或者液氮贮存,干冰运输。
  c. 血液样品:请提供至少2mL血样,并在2小时内处理完毕后加入Trizol。
    全血:用EDTA等抗凝剂处理后的样本,按每200µl全血加入1ml Trizol的比率加入足量Trizol,涡旋摇匀,放入干冰或者-80℃箱保存,干冰运输。
    血浆:用EDTA等抗凝剂处理后的样本,4℃ 4000rpm离心5分钟,上层为血浆样本,按每200µl血浆样本加入1ml Trizol的比率加入足量Trizol,涡旋摇匀,放入干冰或者-80℃冰箱保存,干冰运输。
    血清:用非抗凝管收集血样,静置分离上层血清,按每200uL血清加入1ml Trizol的比率加入足量Trizol,涡旋摇匀,放入干冰或者-80℃冰箱保存,干冰运输。
 d. 细胞样品:
   贴壁细胞
  (1)贴壁细胞培养或处理结束后,去除培养液;
  (2)按每10 cm2培养面积加1 mL Trizol试剂的比例加入Trizol试剂;摇匀,保证所有细胞接触到Trizol而被充分消化;
  (3)用1 ml枪头反复吹打, 并将Trizol细胞悬液转移至RNAase-free的EP管中;
  (4)放入干冰或-80℃冰箱中保存,干冰运输。
  悬浮细胞
  (1)悬浮细胞培养或处理结束后,离心去除培养液;
  (2)保留的细胞用PBS缓冲液快速洗一次,离心除去PBS 缓冲液;
  (3)按照每5×106 个细胞加1 mL Trizol的比例加入Trizol试剂,涡旋振荡使细胞充分悬浮;
  (4)放入干冰或-80℃冰箱中保存,干冰运输。
四、 miRNA qPCR 检测服务方法及仪器
 1. 检测所用试剂均为进口试剂,可根据实验需要选择TaqMan探针法或SYBR Green染料法进行qPCR 检测;
 2.检测仪器型号为ABI 7500,BIO-RAD CFX96

*特异的检测引物


miRNA 荧光定量 PCR(qPCR)检测服务


Fig.1. U6 snRNA (石蜡包埋组织)溶解曲线及扩增曲线

*miRNA差异表达分析


miRNA荧光定量 PCR(qPCR)检测服务

Fig.2.  不同miRNA在Control及Treat(石蜡包埋样品)中差异表达分析

五、miRNA qPCR 检测服务费用
 1.引物设计;
 2.生物样本total RNA 制备及质检;
 3.qPCR 检测:每个样品检测单个miRNA(包括3 个技术重复)

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