RNA干扰整体实验服务—SiRNA实验
第二部分:细胞培养、转染以及siRNA的筛选
一、细胞培养
使用10%胎牛 DMEM培养液,37℃下置于5%CO2培养箱中。待细胞融合至80%,用0.25%胰酶消化传代后接种(细胞密度5 XlO4)于培养瓶或孔板,待细胞融合至约70%后用于实验。以下图片均用显微镜100X拍照
YYYY细胞图片如下:

1)细胞培养方法:略
二、细胞转染
材料:YYYY细胞;XXXX基因siRNA(20Μm, 合成);Lipofectamine 2000试剂(使用前贮存在+4℃);Opti-MEM I 低血清培养基(使用前37℃预热);6孔组织培养板
转染步骤:使用Lipofectamine 2000转染siRNA。转染前一天,4-5×104细胞接种在6孔板上,2mL含FBS的基础培养基;选择用于初期接种的细胞数量,应能在24小时内使细胞汇合达到70%;按照如下的方法准备siRNA- Lipofectamine 2000复合物:a.以250ul Opti-MEM I稀释5ul Lipofectamine 2000,轻轻混匀,室温下孵育5分钟。b.以250ulOpti-MEM I稀释250pmol siRNA,轻轻混匀。c.孵育5分钟后,混合稀释的siRNA和稀释的Lipofectamine 2000,轻轻混合,在室温下孵育20分钟,以便允许复合物的形成。溶液可能出现混浊,但是这不会影响转染;将siRNA - Lipofectamine 2000复合物加入到每一个包含细胞和培养基的孔中。通过轻轻地前后摇动培养板混合;6小时后进行FAM-siRNA荧光检测转染率;37℃,CO2培养箱孵育48小时,进行WB,real-time检测。
转染效率检测:
荧光镜下视野 光镜下视野
通过荧光镜下视野与光镜下视野对比可知,细胞的转染效率达到70%以上可以进行后续的WB real-time检测。
三、siRNA最佳浓度筛选
实验分组:A 正常组;B 阴性对照组;C XXXX-1转染组;D XXXX-2转染组;E XXXX-3转染组
第一个筛选实验:荧光定量PCR实验
实验分组:
实验试剂:Trizol, Invitrogen ,#15596-026;RevertAid H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit, Fermentas #K1631;Deoxyribonuclease I (DNase I), Fermentas #EN0521;RiboLock? Ribonuclease Inhibitor, Fermentas #EO0381;SYBR GreenPCR Master Mix,ABI 4309155;Realtime-PCR仪,ABI 7900型;引物由primer3.0软件设计,并由艾柏森生物合成。步骤(略)。
结果数据:Ct(基本循环数);ΔCt(基本循环与内参循环数差值);ΔΔCt*(最低样本ΔCt值—其它各样本ΔCt值);2-ΔΔCt(RQ) :目的基因mRNA相对含量(* 相对定量以含量最低的样本为标准,其余各样本的含量均为相对该样本的倍数.具体方法参见Kenneth,et al. (2001) METHODS 25, 402–408)。
扩增曲线:在实时荧光PCR扩增反应中,荧光扩增曲线主要分为4个特征性阶段:基线期,指数期初期,指数期,平台期,在软件中显示形状是一条平滑的S型曲线。目的基因的扩增曲线符合4个特征性阶段的平滑的S型曲线,阴性对照(模板为水)无显著荧光信号,提示荧光定量PCR反应程序正常运行,目的基因得到有效扩增,实验操作规范,试剂符合实验要求。
熔点曲线:从软件中显示形状只有一个峰值,没有出现杂峰,提示无非特异性荧光信号,目的基因扩增产物单一,有利于结果分析。

Sample | CT | ΔCт | ΔΔCт | RQ | RQ mean | SD |
1 | 26.1312 | 5.7691 | -2.2238 | 4.6712 | 4.4587 | 0.6585 |
1 | 26.3320 | 6.0975 | -1.8954 | 3.7203 |
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1 | 26.0145 | 5.6754 | -2.3175 | 4.9847 |
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2 | 27.0101 | 5.9786 | -2.0143 | 4.0398 | 3.9841 | 0.0485 |
2 | 27.0077 | 6.0073 | -1.9856 | 3.9603 |
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2 | 27.0584 | 6.0103 | -1.9826 | 3.9520 |
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3 | 28.1032 | 8.3378 | 0.3449 | 0.7874 | 0.5186 | 0.2327 |
3 | 28.7212 | 9.3670 | 1.3741 | 0.3858 |
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3 | 28.5034 | 9.3785 | 1.3856 | 0.3827 |
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4 | 28.0210 | 7.8063 | -0.1866 | 1.1381 | 1.3224 | 0.2119 |
4 | 28.0042 | 7.6421 | -0.3508 | 1.2753 |
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4 | 27.9142 | 7.3570 | -0.6359 | 1.5539 |
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5 | 26.3742 | 7.0578 | -0.9351 | 1.9120 | 2.1770 | 0.3723 |
5 | 26.5004 | 6.6129 | -1.3800 | 2.6027 |
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5 | 26.6316 | 6.9812 | -1.0117 | 2.0163 |
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1-内参 | 20.3621 |
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1-内参 | 20.2345 |
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1-内参 | 20.3391 |
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2-内参 | 21.0315 |
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2-内参 | 21.0004 |
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2-内参 | 21.0481 |
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3-内参 | 19.7654 |
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3-内参 | 19.3542 |
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3-内参 | 19.1249 |
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4-内参 | 20.2147 |
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4-内参 | 20.3621 |
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4-内参 | 20.5572 |
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5-内参 | 19.3164 |
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5-内参 | 19.8875 |
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5-内参 | 19.6504 |
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第二个筛选实验:WB实验
实验试剂:略
WB实验操作流程:略
实验结果:阳性条带以Gel pro4.0 版凝胶光密度分析软件进行分析,测其IOD(integrated optical density)累积光密度参考值。
Lanes: | Lane 1 | Lane 2 | Lane 3 | Lane 4 | Lane 5 |
Rows | (IOD) | (IOD) | (IOD) | (IOD) | (IOD) |
XXXX | 216.21 | 200.86 | 60.691 | 124.52 | 166.52 |
GAPDH | 299.62 | 295.32 | 293.13 | 307.85 | 312.45 |
样本 | A | B | C | D | E |
以上实验得出XXXX-1干预效果最好,可选择做后续实验。
第三部分:细胞增殖、细胞黏附功能、细胞侵袭、细胞迁移实验
实验分组:A 正常细胞培养组;B XXXX-1干预组
一、MTT方法检测细胞毒性
原理:MTT分析法以代谢还原噻唑蓝3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT)为基础。活细胞的线粒体中存在与NADP相关的脱氢酶,可将黄色的MTT还原为不溶性的蓝紫色的甲月赞(Formazan),死细胞此酶消失,MTT不被还原。 用DMSO溶解Formazan后可用酶标仪在570nm(450nm)波长处检测光密度。
操作步骤:在96孔板加入细胞100μL/孔(约1×104),置37℃ 5%CO2细胞培养箱培养24小时;加入适当浓度的受试化合物;将96孔板在37℃,含5% CO2空气及100%湿度的细胞培养箱中孵育适当时间;将5×MTT用 DilutionBuffer稀释成1× MTT;每孔加50μL 1× MTT,在37℃孵育4小时,使MTT还原为甲月赞;吸出上清液,每孔加150μL DMSO使甲月赞溶解,用平板摇床摇匀;酶标仪在570nm波长处检测每孔的光密度。
结果分析:细胞存活率% =(加药细胞OD-本地OD/对照细胞OD-本地OD)×100%。注:本底OD值(完全培养基加MTT,无细胞)
0h 570nm波长各孔OD值:
实验分组 | 样品 | 平行样品 | 平行样品 | 平均值 |
A | 0.457 | 0.452 | 0.463 | 0.457 |
B | 0.461 | 0.448 | 0.454 | 0.454 |
本底 | 0.007 | 0.009 | 0.010 | 0.009 |
12h 570nm波长各孔OD值:
实验分组 | 样品 | 平行样品 | 平行样品 | 平均值 |
A | 0.503 | 0.518 | 0.511 | 0.511 |
B | 0.494 | 0.501 | 0.489 | 0.495 |
本底 | 0.009 | 0.012 | 0.011 | 0.011 |
24h 570nm波长各孔OD值:
实验分组 | 样品 | 平行样品 | 平行样品 | 平均值 |
A | 0.618 | 0.607 | 0.624 | 0.616 |
B | 0.573 | 0.566 | 0.584 | 0.574 |
本底 | 0.007 | 0.008 | 0.008 | 0.008 |
48h 570nm波长各孔OD值:
实验分组 | 样品 | 平行样品 | 平行样品 | 平均值 |
A | 0.744 | 0.765 | 0.738 | 0.749 |
B | 0.636 | 0.663 | 0.657 | 0.652 |
本底 | 0.009 | 0.008 | 0.008 | 0.008 |
72h 570nm波长各孔OD值:
实验分组 | 样品 | 平行样品 | 平行样品 | 平均值 |
A | 0.821 | 0.817 | 0.834 | 0.824 |
B | 0.701 | 0.724 | 0.695 | 0.707 |
本底 | 0.013 | 0.008 | 0.009 | 0.010 |

二、细胞粘附能力实验
试剂耗材及仪器设备:结晶紫染色液;1×PBS, 实验室常备,配方参照《分子克隆实验指南 第二版》;仪器:美国bio-rad公司酶标仪 #680
操作步骤:采用结晶紫染色法测定。将Fn和Ln用1×PBS液分别稀释成100μg/ml和200μg/ml,以每孔100μl分别包被96孔板;37℃包被2h,用1×PBS洗涤2次,再用1% BSA封闭2h。;将各组细胞按常规方法收集后用无血清培养基制成单细胞悬液,每个样本计数3次取平均数,调节细胞浓度为3×105个/ml,以每孔200μl加入包被好的培养板中,置37℃,5%CO2培养箱中孵育2h;取出96孔板,轻轻洗去未粘附的细胞,每孔用100μl 4%中性甲醛固定,30分钟后洗去;每孔加100μl 0.5%结晶紫,室温染色2h,,蒸馏水洗涤一次,阴干后每孔加入100μl 2% SDS溶液,放置酶标仪中570nm波长测定各孔OD值。
检测结果:
0h 570nm波长各孔OD值:
Ln OD值
分组 | 样品 | 平行样品 | 平行样品 | 平均值 |
A | 0.586 | 0.563 | 0.592 | 0.580 |
B | 0.575 | 0.580 | 0.577 | 0.577 |
Fn OD值
分组 | 样品 | 平行样品 | 平行样品 | 平均值 |
A | 0.649 | 0.633 | 0.654 | 0.645 |
B | 0.627 | 0.641 | 0.638 | 0.635 |
12h 570nm波长各孔OD值:
Ln OD值
分组 | 样品 | 平行样品 | 平行样品 | 平均值 |
A | 0.594 | 0.584 | 0.571 | 0.583 |
B | 0.546 | 0.543 | 0.558 | 0.549 |
Fn OD值
分组 | 样品 | 平行样品 | 平行样品 | 平均值 |
A | 0.656 | 0.639 | 0.643 | 0.646 |
B | 0.609 | 0.611 | 0.603 | 0.608 |
24h 570nm波长各孔OD值:
Ln OD值
分组 | 样品 | 平行样品 | 平行样品 | 平均值 |
A | 0.602 | 0.591 | 0.603 | 0.599 |
B | 0.511 | 0.508 | 0.502 | 0.507 |
Fn OD值
分组 | 样品 | 平行样品 | 平行样品 | 平均值 |
A | 0.671 | 0.665 | 0.653 | 0.663 |
B | 0.563 | 0.574 | 0.585 | 0.574 |
48h 570nm波长各孔OD值:
Ln OD值
分组 | 样品 | 平行样品 | 平行样品 | 平均值 |
A | 0.575 | 0.582 | 0.586 | 0.581 |
B | 0.474 | 0.463 | 0.481 | 0.473 |
Fn OD值
分组 | 样品 | 平行样品 | 平行样品 | 平均值 |
A | 0.648 | 0.659 | 0.661 | 0.656 |
B | 0.521 | 0.516 | 0.534 | 0.524 |
72h 570nm波长各孔OD值:
Ln OD值
分组 | 样品 | 平行样品 | 平行样品 | 平均值 |
A | 0.569 | 0.573 | 0.568 | 0.570 |
B | 0.392 | 0.407 | 0.384 | 0.394 |
Fn OD值
分组 | 样品 | 平行样品 | 平行样品 | 平均值 |
A | 0.636 | 0.641 | 0.652 | 0.643 |
B | 0.489 | 0.476 | 0.486 | 0.484 |
三、细胞侵袭实验
实验材料:Corning公司:Transwell6孔板,孔径8um. BD公司:基底膜Matrigel
Transwell小室制备:在上室的聚碳酸酯膜上加入稀释后的Matrigel (3.9ug/ul) 60-80μl,置37℃ 30min使Matrigel聚合成凝胶。
制备细胞悬液:消化细胞,终止消化后离心弃去培养液,用PBS洗1-2遍,用含BSA的无血清培养基重悬。调整细胞密度至5×104/ml。
接种细胞:6孔板下室加入1ml含FBS的培养基。上室加入细胞悬液,培养细胞。
结果统计:用棉签擦去基质胶和上室内的细胞;用95%酒精固定15-20min;HE染色10分钟;
细胞计数:取5个视野于倒置显微镜观察照相(放大倍数400)
A

平均107个细胞
B

平均66个细胞
A

平均98个细胞
B

平均54个细胞
A

平均103个细胞
B

平均61个细胞
四、细胞迁移实验
材料:Corning公司:Transwell6孔板,孔径8um.
制备细胞悬液:消化细胞,终止消化后离心弃去培养液,用PBS洗1-2遍,用含BSA的无血清培养基重悬。调整细胞密度至5×104/ml。
接种细胞:6孔板下室加入1ml含FBS的培养基;取细胞悬2ml加入Transwell小室;培养细胞:常规培养24h。
结果统计:用棉签擦去上室内的细胞;用95%酒精固定15-20min;HE染色10分钟;细胞计数:取5个视野于倒置显微镜观察照相(放大倍数400)
A

平均119个细胞
B

平均54个细胞
A

平均115个细胞
B

平均52个细胞
A

平均121个细胞
B
