RNA干扰整体实验服务—SiRNA实验

RNA干扰整体实验服务—SiRNA实验

第二部分：细胞培养、转染以及siRNA的筛选
一、细胞培养
使用10％胎牛 DMEM培养液，37℃下置于5％CO2培养箱中。待细胞融合至80％，用0．25％胰酶消化传代后接种(细胞密度5 XlO4)于培养瓶或孔板，待细胞融合至约70％后用于实验。以下图片均用显微镜100X拍照
YYYY细胞图片如下：

1）细胞培养方法：略
二、细胞转染
材料：YYYY细胞；XXXX基因siRNA（20Μm, 合成）；Lipofectamine 2000试剂（使用前贮存在+4℃）；Opti-MEM I 低血清培养基（使用前37℃预热）；6孔组织培养板
转染步骤：使用Lipofectamine 2000转染siRNA。转染前一天，4-5×104细胞接种在6孔板上，2mL含FBS的基础培养基；选择用于初期接种的细胞数量，应能在24小时内使细胞汇合达到70%；按照如下的方法准备siRNA- Lipofectamine 2000复合物：a.以250ul Opti-MEM I稀释5ul Lipofectamine 2000，轻轻混匀，室温下孵育5分钟。b.以250ulOpti-MEM I稀释250pmol siRNA，轻轻混匀。c.孵育5分钟后，混合稀释的siRNA和稀释的Lipofectamine 2000，轻轻混合，在室温下孵育20分钟，以便允许复合物的形成。溶液可能出现混浊，但是这不会影响转染；将siRNA - Lipofectamine 2000复合物加入到每一个包含细胞和培养基的孔中。通过轻轻地前后摇动培养板混合；6小时后进行FAM-siRNA荧光检测转染率；37℃，CO2培养箱孵育48小时，进行WB，real-time检测。
转染效率检测：

　荧光镜下视野                                  光镜下视野
通过荧光镜下视野与光镜下视野对比可知，细胞的转染效率达到70%以上可以进行后续的WB real-time检测。

三、siRNA最佳浓度筛选
实验分组：A 正常组；B 阴性对照组；C XXXX-1转染组；D XXXX-2转染组；E XXXX-3转染组
第一个筛选实验：荧光定量PCR实验
实验分组：

实验试剂：Trizol, Invitrogen ，#15596-026；RevertAid H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit, Fermentas #K1631；Deoxyribonuclease I (DNase I), Fermentas #EN0521；RiboLock? Ribonuclease Inhibitor, Fermentas #EO0381；SYBR GreenPCR Master Mix，ABI 4309155；Realtime-PCR仪,ABI 7900型；引物由primer3.0软件设计,并由艾柏森生物合成。步骤(略)。
结果数据：Ct（基本循环数）；ΔCt（基本循环与内参循环数差值）；ΔΔCt*（最低样本ΔCt值—其它各样本ΔCt值）；2-ΔΔCt（RQ） ：目的基因mRNA相对含量（* 相对定量以含量最低的样本为标准，其余各样本的含量均为相对该样本的倍数.具体方法参见Kenneth，et al. (2001) METHODS 25, 402–408）。
扩增曲线：在实时荧光PCR扩增反应中，荧光扩增曲线主要分为4个特征性阶段：基线期，指数期初期，指数期，平台期，在软件中显示形状是一条平滑的S型曲线。目的基因的扩增曲线符合4个特征性阶段的平滑的S型曲线，阴性对照(模板为水)无显著荧光信号，提示荧光定量PCR反应程序正常运行，目的基因得到有效扩增，实验操作规范，试剂符合实验要求。
熔点曲线：从软件中显示形状只有一个峰值，没有出现杂峰，提示无非特异性荧光信号，目的基因扩增产物单一，有利于结果分析。

第二个筛选实验：WB实验
实验试剂：略
WB实验操作流程：略
实验结果：阳性条带以Gel pro4.0 版凝胶光密度分析软件进行分析，测其IOD（integrated optical density）累积光密度参考值。

以上实验得出XXXX-1干预效果最好，可选择做后续实验。

第三部分：细胞增殖、细胞黏附功能、细胞侵袭、细胞迁移实验
实验分组：A  正常细胞培养组；B  XXXX-1干预组

一、MTT方法检测细胞毒性
原理：MTT分析法以代谢还原噻唑蓝3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT)为基础。活细胞的线粒体中存在与NADP相关的脱氢酶，可将黄色的MTT还原为不溶性的蓝紫色的甲月赞（Formazan），死细胞此酶消失，MTT不被还原。 用DMSO溶解Formazan后可用酶标仪在570nm(450nm)波长处检测光密度。
操作步骤：在96孔板加入细胞100μL/孔（约1×104），置37℃ 5%CO2细胞培养箱培养24小时；加入适当浓度的受试化合物；将96孔板在37℃，含5% CO2空气及100%湿度的细胞培养箱中孵育适当时间；将5×MTT用 DilutionBuffer稀释成1× MTT；每孔加50μL 1× MTT，在37℃孵育4小时，使MTT还原为甲月赞；吸出上清液，每孔加150μL DMSO使甲月赞溶解，用平板摇床摇匀；酶标仪在570nm波长处检测每孔的光密度。
结果分析：细胞存活率% =（加药细胞OD-本地OD/对照细胞OD-本地OD）×100％。注：本底OD值（完全培养基加MTT，无细胞）
0h 570nm波长各孔OD值：

12h 570nm波长各孔OD值：

24h 570nm波长各孔OD值：

48h 570nm波长各孔OD值：

72h 570nm波长各孔OD值：

二、细胞粘附能力实验
试剂耗材及仪器设备：结晶紫染色液；1×PBS, 实验室常备，配方参照《分子克隆实验指南 第二版》；仪器：美国bio-rad公司酶标仪 #680
操作步骤:采用结晶紫染色法测定。将Fn和Ln用1×PBS液分别稀释成100μg/ml和200μg/ml，以每孔100μl分别包被96孔板；37℃包被2h，用1×PBS洗涤2次，再用1% BSA封闭2h。；将各组细胞按常规方法收集后用无血清培养基制成单细胞悬液，每个样本计数3次取平均数，调节细胞浓度为3×105个/ml，以每孔200μl加入包被好的培养板中，置37℃，5%CO2培养箱中孵育2h；取出96孔板，轻轻洗去未粘附的细胞，每孔用100μl 4%中性甲醛固定，30分钟后洗去；每孔加100μl 0.5%结晶紫，室温染色2h,，蒸馏水洗涤一次，阴干后每孔加入100μl 2% SDS溶液，放置酶标仪中570nm波长测定各孔OD值。
检测结果：
0h  570nm波长各孔OD值：
Ln OD值

Fn OD值

12h  570nm波长各孔OD值：
Ln OD值

Fn OD值

24h  570nm波长各孔OD值：
Ln OD值

Fn OD值

48h  570nm波长各孔OD值：
Ln OD值

Fn OD值

72h  570nm波长各孔OD值：
Ln OD值

Fn OD值

三、细胞侵袭实验
实验材料：Corning公司:Transwell6孔板，孔径8um. BD公司:基底膜Matrigel
Transwell小室制备：在上室的聚碳酸酯膜上加入稀释后的Matrigel (3.9ug/ul) 60-80μl，置37℃ 30min使Matrigel聚合成凝胶。
制备细胞悬液：消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，用PBS洗1－2遍，用含BSA的无血清培养基重悬。调整细胞密度至5×104/ml。
接种细胞：6孔板下室加入1ml含FBS的培养基。上室加入细胞悬液，培养细胞。
结果统计：用棉签擦去基质胶和上室内的细胞；用95%酒精固定15-20min；HE染色10分钟；

细胞计数：取5个视野于倒置显微镜观察照相（放大倍数400）
A  

平均107个细胞
B  

平均66个细胞
A

平均98个细胞
B  

平均54个细胞
A  

平均103个细胞
B  

平均61个细胞

四、细胞迁移实验
材料：Corning公司:Transwell6孔板，孔径8um.
制备细胞悬液：消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，用PBS洗1－2遍，用含BSA的无血清培养基重悬。调整细胞密度至5×104/ml。
接种细胞：6孔板下室加入1ml含FBS的培养基；取细胞悬2ml加入Transwell小室；培养细胞：常规培养24h。
结果统计：用棉签擦去上室内的细胞；用95%酒精固定15-20min；HE染色10分钟；细胞计数：取5个视野于倒置显微镜观察照相（放大倍数400）
A  

平均119个细胞
B

平均54个细胞
A  

平均115个细胞
B

平均52个细胞
A  

平均121个细胞
B